資訊中心
作者：翁志明
發(fā)布時間：2026-01-23
閱讀：625
生物分子間的相互作用是生命活動的基石，分子間結(jié)合的特異性、強(qiáng)弱、快慢等都是生命科學(xué)研究的重要內(nèi)容。基于表面等離子共振（Surface Plasmon Resonance, SPR）和生物膜干涉技術(shù)（Bio-Layer Interferometry, BLI）這兩種無標(biāo)記的、實(shí)時監(jiān)測分子相互作用的光學(xué)檢測技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各類生物分子的互作分析、發(fā)病機(jī)制研究、藥物發(fā)現(xiàn)及開發(fā)、生產(chǎn)質(zhì)控等重要領(lǐng)域。本文將對這兩種已經(jīng)被美國藥典收錄的分子互作檢測技術(shù)做簡要的介紹。
SPR簡史
1902年，科學(xué)家Wood在光學(xué)實(shí)驗(yàn)中首次發(fā)現(xiàn)了SPR現(xiàn)象：當(dāng)偏振光照向金屬背襯的衍射光柵時，反射光中會出現(xiàn)異常的明暗條紋圖案。盡管他對光、光柵和金屬之間的相互作用機(jī)制進(jìn)行了推測，但這一現(xiàn)象當(dāng)時并未得到清晰的解釋。1941年，F(xiàn)ano對SPR現(xiàn)象進(jìn)行理論分析，認(rèn)為這些異常與由（光柵）結(jié)構(gòu)支持的表面波（表面等離子體）相關(guān)。1950年代，科學(xué)家在氣體和薄膜上的電子能量損失方面進(jìn)行了更多實(shí)驗(yàn)。研究表明，能量損失來自于表面等離子體振蕩的激發(fā)，其中部分恢復(fù)電場延伸到了樣品邊界之外。因此，樣品表面上的任何薄膜或污染物都會影響表面等離子體振蕩。這一效應(yīng)后來被描述為金屬表面激發(fā)電磁“倏逝”波。到了1970年代，倏逝波被描述為一種研究超薄金屬膜和涂層的手段[1]。
光學(xué)激發(fā)表面等離子體波主要采用兩種方法：基于棱鏡耦合器結(jié)構(gòu)的衰減全反射法以及光柵衍射法。1960年代末1970年代初，Kretschmann、Raether和Otto通過衰減全反射方法演示了表面等離子體的光學(xué)激發(fā)，為SPR傳感器結(jié)構(gòu)奠定了基礎(chǔ)。到了1980年，SPR及其相關(guān)利用倏逝波的技術(shù)被應(yīng)用于薄膜表征以及生物和化學(xué)相互作用研究。這些技術(shù)使研究者能夠?qū)崟r、無需標(biāo)記地研究溶液中固定化受體與目標(biāo)分析物之間的相互作用。1980年，Pharmacia公司對SPR技術(shù)產(chǎn)生興趣并開始研究該技術(shù)的潛力。1984年，Pharmacia公司成立了子公司Pharmacia Biosensor AB，致力于開發(fā)、生產(chǎn)和銷售實(shí)用的SPR儀器。1990年，Pharmacia Biosensor AB開發(fā)出首臺商業(yè)化SPR儀器BIAcore。1996年，Biacore從原Pharmacia公司剝離出來獨(dú)立運(yùn)營，于2006年被GE收購，成為GE醫(yī)療生命科學(xué)大家庭中的一員。2019年，Danaher（丹納赫）公司收購GE醫(yī)療生命科學(xué)事業(yè)部，Biacore成為旗下新品牌Cytiva（思拓凡）的一部分。自1990年至今，Biacore推陳出新先后推出了一系列SPR分子互作儀：Biacore 1000、Biacore 2000、Biacore X、Biacore 3000、Biacore Q、Biacore J、Biacore A100、Biacore T100、Biacore T200、Biacore 4000、Biacore X100、Biacore S200、Biacore 8K系列和Biacore 1系列等。經(jīng)過35年的發(fā)展，Biacore已成為無標(biāo)記分子互作檢測技術(shù)的金標(biāo)準(zhǔn)。
Biacore中的SPR原理
表面等離子共振（Surface Plasmon Resonance, SPR）是一種光學(xué)物理現(xiàn)象。Biacore分子互作儀采用棱鏡耦合的衰減全反射（ATR）方式激發(fā)金膜表面SPR。當(dāng)一束固定波長的偏振光以特定角度范圍（大于臨界角）入射到棱鏡-金膜界面時，會在金膜的外表面樣品溶液一側(cè)產(chǎn)生倏逝波（evanescent wave）。它是沿著界面?zhèn)鞑ィ以诖怪苯缑娣较蛑笖?shù)衰減的電磁場。倏逝波的穿透深度通常在光波長量級。當(dāng)倏逝波的波矢（kx）與金膜表面的表面等離子體激元（SPP）的波矢（ksp）滿足動量匹配條件（kx = ksp）時，入射光的大部分能量通過倏逝波被高效耦合轉(zhuǎn)移至金膜表面的表面等離子體激元（SPP），引發(fā)自由電子沿界面方向的集體相干振蕩。此時光能量被大量吸收，反射光強(qiáng)在共振角處出現(xiàn)極小值（反射谷）。當(dāng)分子結(jié)合到金膜表面的生物傳感層（如羧甲基葡聚糖基質(zhì)）時，表面局域折射率升高，導(dǎo)致ksp增大，共振角正向移動；分子解離時折射率降低，共振角負(fù)向移動。通過實(shí)時監(jiān)測共振角位移（Δθ）——在軟件中轉(zhuǎn)化為共振單位（RU）（1 RU = 0.0001° 共振角位移 ≈ 10-6 RIU折射率變化 ≈ 1 pg/mm² 質(zhì)量變化），即可動態(tài)解析分子結(jié)合/解離動力學(xué)過程（圖1）。
圖1. Biacore系統(tǒng)使用SPR檢測分子互作[2]
在傳統(tǒng)SPR技術(shù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化和拓展
2011年，芬蘭的BioNavis公司推出首款基于多參數(shù)表面等離子共振（MP-SPR）技術(shù)實(shí)現(xiàn)多波長同步測量的商業(yè)化儀器。其傳感器芯片體系通過創(chuàng)新材質(zhì)（銀、鉑、銅、鋁、二氧化鈦、二氧化硅、羧甲基葡聚糖、鎳離子等）實(shí)現(xiàn)大幅擴(kuò)展。和傳統(tǒng)SPR分子互作儀相比，該儀器可以規(guī)避折射率干擾，適用于血清/組織裂解液等復(fù)雜基質(zhì)，可以實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞層面藥物滲透動力學(xué)無標(biāo)記實(shí)時監(jiān)測。
傳統(tǒng)SPR分子互作儀 (例如Biacore)通常使用棱鏡耦合，通過角度或波長掃描檢測單個或幾個位點(diǎn)的結(jié)合事件，雖然精度很高，但通量通常較低，一次實(shí)驗(yàn)只能分析一個或少數(shù)幾個相互作用對。而基于SPR成像（SPR imaging，SPRi）的分子互作儀雖然精度低一些，卻可以實(shí)現(xiàn)高通量檢測。和固定波長掃描角度或者固定角度掃描波長的傳統(tǒng)SPR相比，SPRi是在固定角度和固定波長的條件下用平行光源照射整個芯片，使用高分辨率相機(jī)實(shí)時捕獲整個芯片區(qū)域的反射光強(qiáng)度變化圖像。通過分析圖像上所有獨(dú)立位點(diǎn)的反射光強(qiáng)隨時間的變化（分子結(jié)合導(dǎo)致芯片表面局部折射率變化 → 反射光強(qiáng)度改變），可以實(shí)時地獲取所有位點(diǎn)上發(fā)生的分子結(jié)合和解離動力學(xué)數(shù)據(jù)。將SPRi技術(shù)和微流控技術(shù)結(jié)合以后可以并行實(shí)時地監(jiān)測芯片上成百上千個獨(dú)立位點(diǎn)的相互作用。Carterra公司的SPRi分子互作儀最高通量可以同時檢測1個分析物和384個配體之間的相互作用。
自2016年起，Nicoya等公司基于局域表面等離子共振（Localized SPR/LSPR）開發(fā)出小巧的臺式分子互作儀。與傳統(tǒng)SPR使用平面表面不同，LSPR是在納米顆粒上激發(fā)的。LED白光照射金屬納米顆粒時，其連續(xù)光譜中與納米顆粒匹配的特定波長會激發(fā)顆粒內(nèi)自由電子發(fā)生集體相干振蕩。共振導(dǎo)致該波長處消光（吸收+散射）顯著增強(qiáng)，在光譜上形成特征共振峰。當(dāng)分子結(jié)合至納米顆粒表面（或從納米顆粒表面解離）時，其局域表面介電環(huán)境（折射率）發(fā)生變化，導(dǎo)致共振峰位置發(fā)生紅移（或藍(lán)移）。通過實(shí)時監(jiān)測共振峰位置的動態(tài)位移（Δλ），可解析分子結(jié)合/解離的動力學(xué)過程（圖2）。
采用LSPR技術(shù)的儀器無需傳統(tǒng)SPR的大型光學(xué)組件和液體處理系統(tǒng)，儀器體積很小，并且對溫度和體相折射率變化的敏感度更低。2020年，Nicoya公司推出了16通道的Alto儀器，該儀器利用數(shù)字微流控技術(shù)使樣品在檢測區(qū)域上方移動。我國的量準(zhǔn)公司也基于LSPR推出了多款分子互作儀，最新的WeSPR 300是96通道并行檢測通道，可以在10分鐘內(nèi)完成96對分子互作親和力的測定和篩選。
圖2. 使用局域表面等離子共振（LSPR）檢測分子互作[3]
BLI簡史
在表面等離子共振（SPR）技術(shù)發(fā)展的同時，科學(xué)家們也積極探索其他無標(biāo)記分子相互作用檢測方法。雖然大部分嘗試都失敗了，但是生物膜干涉技術(shù)（Bio-Layer Interferometry, BLI）的商業(yè)化卻大獲成功。BLI的物理基礎(chǔ)可追溯至1999年，S-W Kim和G-H Kim將白光掃描干涉技術(shù)（Wavelength-Scanning Interferometry, WSI） 應(yīng)用于透明薄膜厚度輪廓測量領(lǐng)域。他們通過先進(jìn)的頻域分析和非線性擬合算法，成功地實(shí)現(xiàn)了對薄膜層雙界面的同步、獨(dú)立檢測[4]。
2001年，F(xiàn)ortéBio公司成立，致力于將白光干涉原理創(chuàng)新性地應(yīng)用于生物分子相互作用實(shí)時檢測。其核心技術(shù)是開發(fā)了一種特殊的一次性光纖生物傳感器探針（Dip and Read®）。探針末端包被特定功能層（如鏈霉親和素、蛋白A/G等），為分子（配體）提供固定化表面。2006年，基于此技術(shù)的首款商業(yè)化Octet儀器正式發(fā)布。憑借其無需標(biāo)記、免流路設(shè)計(jì)（顯著簡化操作）、高檢測通量、儀器維護(hù)相對簡便等顯著優(yōu)勢，BLI技術(shù)迅速在抗體開發(fā)、藥物篩選、生物工藝監(jiān)控等制藥、生物技術(shù)和學(xué)術(shù)研究領(lǐng)域獲得廣泛應(yīng)用，市場占有率快速提升。2020年，Sartorius收購FortéBio后，持續(xù)投入研發(fā)，推出了新一代Octet® R系列平臺（如R2/R4/R8/RH16/RH96系統(tǒng)）。該平臺在靈敏度、檢測通量、動態(tài)范圍和易用性上進(jìn)一步提升，并配備了更新的用戶界面與更強(qiáng)大的數(shù)據(jù)分析軟件。
2017年，F(xiàn)ortéBio公司的創(chuàng)始人再次回到BLI技術(shù)領(lǐng)域，重新成立了一家公司：Gator Bio（小鱷生物），致力于使用新一代BLI技術(shù)優(yōu)化傳感器表面，改進(jìn)光學(xué)鍍膜，大幅提升靈敏度和檢測范圍。短短幾年時間，Gator Bio就開發(fā)出Gator Pilot、Gator Prime、Gator Plus、Gator Pivot和Gator Pro五款BLI分子互作儀和30多種傳感器。Gator Bio擁有BLI的發(fā)明團(tuán)隊(duì)，技術(shù)服務(wù)水平行業(yè)一流。他們不僅在耗材方面能夠根據(jù)客戶特殊樣本需求定制傳感器，在儀器方面也能為前沿研究機(jī)構(gòu)進(jìn)行定制化開發(fā)。Gator Bio期望未來3-5年內(nèi)在全球BLI市場中占據(jù)主導(dǎo)地位，不僅要奪取中國國內(nèi)市場份額，更要在全球范圍內(nèi)成為領(lǐng)導(dǎo)者。
總之，首臺BLI分子互作儀問世至今雖然不足20年，但是其發(fā)展迅猛并取得了顯著的成功。BLI有后來居上的趨勢，目前和SPR一樣，廣泛應(yīng)用在涉及分子互作的各個領(lǐng)域中。SPR和BLI這兩種分子互作檢測技術(shù)分別于2016年和2021年被美國藥典收錄，意味著BLI和SPR一樣，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性、重復(fù)性和靈敏度均已通過嚴(yán)格認(rèn)證，滿足藥物研發(fā)與質(zhì)量控制的嚴(yán)苛要求。
BLI原理
生物膜干涉技術(shù)（Bio-Layer Interferometry，BLI）基于白光干涉技術(shù)（White Light Interferometry）原理。寬譜光源發(fā)出的白光近垂直入射到生物傳感探針的末端表面（傳感表面）。光線在其表面經(jīng)歷以下過程：在傳感表面（第一界面，即末端功能層-液體界面），入射光發(fā)生部分反射（形成第一束反射光），部分透射進(jìn)入末端固定層。透射光到達(dá)傳感層（固定有配體分子的生物分子層）的遠(yuǎn)端（第二界面，即傳感層-溶液界面） 時，再次發(fā)生部分反射（形成第二束反射光）。這兩束反射光返回到探測器時，由于光程差不同而產(chǎn)生干涉。光譜儀記錄下這組相干光形成的干涉光譜（通常表現(xiàn)為周期性振蕩圖譜）。
關(guān)鍵的生物物理過程發(fā)生在傳感表面：
結(jié)合（Association）：當(dāng)溶液中的分析物（Analyte）與固定在傳感表面上的配體（Ligand） 結(jié)合時，傳感表面生物分子層的厚度增加。
解離（Dissociation）：當(dāng)結(jié)合的復(fù)合物解離時，傳感表面生物分子層的厚度減小。
生物分子層厚度的細(xì)微變化（通常在nm級甚至亞nm級）會改變兩束反射光之間的光程差。這直接導(dǎo)致其干涉光譜發(fā)生變化：光譜特征峰或谷的位置（波長λ）發(fā)生偏移（Δλ）。 結(jié)合時厚度增加，通常導(dǎo)致偏移向長波長方向移動（Δλ > 0）；解離時厚度減小，則偏移向短波長方向移動（Δλ < 0）。實(shí)時連續(xù)監(jiān)測這個特征波長偏移（Δλ）隨時間（t）的變化軌跡（即傳感圖譜 Sensorgram），即可實(shí)現(xiàn)對分子結(jié)合與解離過程的實(shí)時、無標(biāo)記監(jiān)測（圖3）。 通過對傳感圖譜的定量分析，就可以獲取分子互作的動力學(xué)參數(shù)以及親和力參數(shù)，并可在一定條件下用于分析物濃度的測定。
圖3. 使用BLI檢測分子互作[5]
商業(yè)化分子互作儀有哪些？
目前市場SPR主流設(shè)備還是Cytiva的Biacore系列，科研機(jī)構(gòu)和企業(yè)里常用的Biacore T200和Biacore S200已經(jīng)停產(chǎn)，其售后維保服務(wù)會持續(xù)到2030年6月30日。目前在售的儀器有入門級Biacore X100、Biacore T200和Biacore S200的替代品Biacore 1系列（Biacore 1K、Biacore 1K+、Biacore 1S+）和高通量型號Biacore 8K系列（Biacore 8K、Biacore 8K+）。Biacore 1系列和Biacore T200/S200相比增加了2個流通池至6個流通池，提高了50%的檢測通量。Biacore 8K系列專為高通量、高靈敏度應(yīng)用而設(shè)計(jì)，配備16個檢測通道，可在親和力、動力學(xué)、表位及濃度分析應(yīng)用中提供無與倫比的效率與高質(zhì)量數(shù)據(jù)。該系統(tǒng)可以在24小時內(nèi)篩選2300個樣本。深耕市場多年，Biacore系統(tǒng)的高靈敏度、高分辨率和高穩(wěn)定性得到了廣大用戶的認(rèn)可。經(jīng)過30多年的發(fā)展，Biacore已成為無標(biāo)記分子互作檢測技術(shù)的金標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)然，Biacore系統(tǒng)也有它的缺點(diǎn)，就是購買費(fèi)用和售后維保費(fèi)用都較高。
Sartorius公司于2022年在原來兩款SPR分子互作儀（Pioneer和Pioneer FE）基礎(chǔ)上推出了一款全新的SPR儀器：Octet SF3 SPR，擁有3個流動通道，優(yōu)化了流路系統(tǒng)，可以降低維保費(fèi)用。該設(shè)備使用獨(dú)有的OneStep®梯度進(jìn)樣（OneStep® Gradient Injections）模式，測定動力學(xué)數(shù)據(jù)只需要準(zhǔn)備一個分析物濃度，可顯著縮短實(shí)驗(yàn)開發(fā)時間，在不到24小時內(nèi)完成768個分子的動力學(xué)測定。
BRUKER公司在售的SPR分子互作儀有Sierra SPR-24 Pro、Sierra SPR-32 Pro和SPR #64這3款儀器，其8×3、8×4和8×8的檢測模式和BioRad公司已經(jīng)停產(chǎn)的ProteOn XPR36 6×6檢測模式類似，允許一次實(shí)驗(yàn)同時檢測多個分析物和多個配體之間的相互作用。
XanTec bioanalytics GmbH公司也有三款產(chǎn)品在售：Reichert 2SPR、Reichert 3SPR和Reichert 4SPR，分別有2個、3個和4個通道。這些產(chǎn)品主打一個高性價(jià)比，5年持有成本比市場主流競品節(jié)省30-70%。另一個賣點(diǎn)是可以分析含有全細(xì)胞的粗樣品。
Carterra公司將專利微流體技術(shù)與實(shí)時高通量表面等離子共振（HT-SPR）和行業(yè)領(lǐng)先的數(shù)據(jù)分析和可視化軟件相結(jié)合，極大地加快了大分子和小分子藥物的發(fā)現(xiàn)速度。最高通量可以同時檢測1個分析物和384個配體之間的相互作用。和現(xiàn)有其他平臺相比，可以在10%的時間內(nèi)和使用1%樣品的條件下獲得100倍的通量。目前在售分子互作儀有Carterra LSA、Carterra LSAXT和Carterra Ultra。
北京英柏生物科技有限公司（Inter-Bio）歷時多年研制，突破多個技術(shù)痛點(diǎn)和難關(guān)，于2019年成功推出了國內(nèi)第一臺自主研發(fā)的商業(yè)化SPR分子互作儀MI-S200，此后推出了幾款升級版MI-S200。MI-S200系列分子互作儀整體性能穩(wěn)定，親和力測定數(shù)據(jù)結(jié)果重復(fù)性高，和Biacore儀器獲得的結(jié)果非常接近。MI-S200系列分子互作儀性價(jià)比高，自主研發(fā)的配套生物芯片等耗材和更加皮實(shí)耐用的微流路系統(tǒng)也都極大降低了用戶的使用成本。目前在售型號有MI-S200E和 MI-S200F。
極瞳生命科技（蘇州）有限公司也開發(fā)了國產(chǎn)SPR系統(tǒng)，目前在售型號有：P4、P4 PRO、S-LITE（專業(yè)型）和S-CLASS（旗艦型）。P4和P4 PRO基于標(biāo)準(zhǔn)多孔板設(shè)計(jì)的4針8通道，支持4針平行或獨(dú)立操作；S-LITE和S-CLASS基于標(biāo)準(zhǔn)多孔板設(shè)計(jì)的8針16通道，支持8針平行或獨(dú)立操作。集成式微米級流路控制系統(tǒng)，確保了儀器具有超高靈敏度，從容應(yīng)對各類復(fù)雜樣品的高通量篩選和表征。
Nicoya公司基于納米結(jié)構(gòu)傳感器的局域表面等離子共振技術(shù)（LSPR）設(shè)計(jì)了小巧的臺式SPR分子互作儀。OpenSPR系列可提供高質(zhì)量、無標(biāo)記相互作用分析結(jié)果。親和力數(shù)據(jù)重復(fù)性和靈敏度高。而Alto系統(tǒng)則整合了數(shù)字微流控（DMF）及納米技術(shù)，可適用于粗提樣品，且無需維護(hù)。DMF技術(shù)能精準(zhǔn)控制0.35 μL液滴，因此完成一輪親和力實(shí)驗(yàn)只需2 μL樣品。該系統(tǒng)具有靈活的16通道設(shè)計(jì)和直觀的數(shù)據(jù)分析平臺，方便用戶使用并對實(shí)驗(yàn)過程進(jìn)行實(shí)時優(yōu)化。
上海量準(zhǔn)公司采用下一代表面等離子共振——納米超表面等離子共振（MetaSPR）技術(shù)開發(fā)了多款SPR儀器，產(chǎn)品包括有：WeSPR One、WeSPR One Auto、WeSPR 100X、WeSPR 200、WeSPR HT8、WeSPR 300等多種型號，適用于生物分子的研究、發(fā)現(xiàn)或篩選應(yīng)用。優(yōu)勢是持有成本較低。板孔式無流路設(shè)計(jì)，整機(jī)無需復(fù)雜的液路維護(hù)操作，即開即用，即關(guān)即走。兼容粗樣品，無需進(jìn)行樣品預(yù)處理即可進(jìn)行檢測，提供更廣泛的應(yīng)用范圍。最新的WeSPR 300是96通道并行檢測通道，可以在10分鐘內(nèi)完成96對分子互作親和力的測定和篩選。
目前市場上基于BLI的分子互作儀主要有FortéBio/Sartorius的Octet系列和Gator Bio的Gator系列產(chǎn)品。FortéBio公司在被Sartorius收購之前推出的多款Octet系統(tǒng)（Octet QKe、Octet QK384、Octet RED96、Octet RED96e、Octet RED384、Octet HTX等）仍然被廣泛使用。2020年，Sartorius收購FortéBio以后，推出了新一代Octet R系列平臺。目前在售的Octet系列有：Octet N1、Octet R2、Octet R4、Octet R8、Octet R8e、Octet RH16、Octet RH96。Octet R8e是Octet系列中靈敏度和精確度最高的一款分子互作儀，能夠精確檢測小分子和低濃度分析物，優(yōu)化蒸發(fā)控制功能可將樣品濃度穩(wěn)定維持長達(dá)16小時，適合檢測緩慢結(jié)合或者緩慢解離的互作。該系統(tǒng)兼容384孔微孔板，可實(shí)現(xiàn)高通量檢測，所需樣品體積最低僅需 40 μL。而Octet RH96則是通量最高的Octet分子互作儀，可以同時分析96個樣品，僅需數(shù)分鐘即可完成整個96孔板中分析物的定量或結(jié)合分析。可以直接分析上清液或裂解液中的樣本，在八小時內(nèi)即可完成一個32x32表位分組實(shí)驗(yàn)。
Gator Bio（小鱷生物）目前擁有Gator Pilot、Gator Prime、Gator Plus、Gator Pivot和Gator Pro這五款BLI分子互作儀和30多種傳感器。Gator Plus可同時檢測八個通道，該儀器經(jīng)過優(yōu)化后增強(qiáng)了基線的穩(wěn)定性，擁有更高的信噪比，可為各種生物分子，包括小分子、抗體和其他蛋白質(zhì)等各種復(fù)雜的分子對提供高質(zhì)量的數(shù)據(jù)分析，還能輕松檢測pM級別的親和力。Gator Pro在這5款儀器中通量最高，具備32通道檢測能力，3個樣本板位（96或384孔板），單次運(yùn)行最多可檢測1152個樣本，可以在八小時內(nèi)完成一個32x32表位分組實(shí)驗(yàn)。
總之，目前市場上流行的SPR和BLI分子互作儀是很多樣化的，價(jià)格、精度和通量等方面各有不同。用戶可以根據(jù)預(yù)算和實(shí)驗(yàn)需求來選擇合適的分子互作儀。
分子互作的實(shí)驗(yàn)流程
雖然SPR和BLI分子互作儀檢測分子相互作用的操作方式有些不同（進(jìn)樣針注射樣品流過芯片表面的微流體流通池 VS 光纖生物傳感器探針“浸入”微幅振動樣品板上的樣品中），但它們實(shí)驗(yàn)流程基本相同。實(shí)驗(yàn)流程基本都包括以下這些步驟：基線走平、固定配體（ligand）、基線走平、分析物（analyte）和配體結(jié)合、分析物解離、芯片再生、數(shù)據(jù)分析。
“固定”在sensor（SPR芯片或者BLI探針）表面的生物分子稱為“配體”，和配體相互作用的分子稱為“分析物”。配體可以通過氨基偶聯(lián)等方法直接固定到sensor表面，很多時候還可以通過捕獲分子間接固定。廠家提供了多種類型的sensor，方便科研人員根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行選擇。固定好配體和基線走平以后，就可以讓合適濃度的分析物和配體結(jié)合一段時間（一般0.5-5分鐘），結(jié)合階段結(jié)束以后讓運(yùn)行緩沖液流過芯片表面或者探針浸入運(yùn)行緩沖液中，就可以讓分析物從sensor表面的配體/分析物復(fù)合物上解離下來（解離時間視親和力而定，一般介于1-60分鐘）。芯片再生時使用合適的再生條件讓分析物完全從配體上解離或者讓分析物/配體完全從sensor表面解離（圖4）。完成再生步驟以后就可以反復(fù)上樣，進(jìn)入下一個循環(huán)檢測第二個濃度的分析物和配體之間的相互作用。多循環(huán)動力學(xué)（multiple-cycle kinetics）通常使用一系列不同濃度的分析物重復(fù)步驟結(jié)合-解離-再生的過程。
圖4. 分子互作實(shí)驗(yàn)的一般流程[2]
實(shí)驗(yàn)結(jié)束以后，使用分子互作儀配套的分析軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，一般是對扣除零濃度信號以后的數(shù)據(jù)使用1：1結(jié)合模型進(jìn)行擬合，可以獲得一整套完整的動力學(xué)數(shù)據(jù)（結(jié)合速率常數(shù)ka、解離速率常數(shù)kd和平衡解離常數(shù)KD）。KD值越大，親和力越低；KD值越小，親和力越高。例如野生型T細(xì)胞受體（TCR）和相應(yīng)的抗原肽-主要組織相容性復(fù)合體（pMHC）之間的親和力較低，KD值一般介于10-5 - 3×10-4 M[6]。野生型TCR經(jīng)過親和力成熟以后，親和力大幅度提升，KD值可達(dá)到pM級別。2022年上市的首款TCR療法以及首款治療實(shí)體腫瘤的雙特異性T細(xì)胞接頭藥物Tebentafusp其TCR結(jié)構(gòu)域和相應(yīng)pMHC之間的親和力較野生型TCR提高了一百萬倍，Biacore分子互作儀測出來的KD值為24 pM，半衰期t1/2為27小時[7]，根據(jù)公式t1/2=ln(2)/kd計(jì)算出解離速率常數(shù)kd值大約為7.1×10-6 1/s，根據(jù)公式KD=kd/ka計(jì)算出結(jié)合速率常數(shù)ka值大約為3×105 1/Ms。
SPR分子互作儀和BLI分子互作儀親和力測定結(jié)果差異大么？
2008年，輝瑞公司的科研人員使用Octet QK、Biacore 3000和ProteOn XPR36分別對一個鼠抗CGRP單克隆抗體的Fab片段和固定在芯片表面的抗原之間的親和力進(jìn)行了測定[8]，結(jié)果表明三個平臺測出來的親和力數(shù)據(jù)之間沒有顯著的差異。但是早期型號的Octet QK由于精度比較有限，當(dāng)分析物分子量比較小的時候，難以使用Octet QK直接測定。
2016年的一項(xiàng)研究則同時使用4種分子互作儀（Biacore T100、ProteOn XPR36、Octet RED384和IBIS MX96）對10個高親和力抗體和相應(yīng)的抗原之間的親和力進(jìn)行了測定[9]。結(jié)果表明，SPR分子互作儀（Biacore T100和ProteOn XPR36）在數(shù)據(jù)質(zhì)量和一致性方面表現(xiàn)優(yōu)異，而BLI分子互作儀（Octet RED384）則展現(xiàn)出高度的靈活性和高通量，但在數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性和可重復(fù)性方面稍微差一些。
2017年，Vishal Kamat和Ashique Rafique使用Octet HTX（BLI）、Biacore 4000（SPR）和MASS-1（SPRi）這3款分子互作儀分別對大量的抗體/抗原之間的親和力進(jìn)行了測定和比較[10]。結(jié)果表明，經(jīng)過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件（抗體捕獲量不高于0.6 nm）以后，使用Octet分子互作儀可以獲得和SPR/SPRi分子互作儀類似的結(jié)果。他們還發(fā)現(xiàn)：在測定超高親和力（解離速率很慢，kd值<5×10-5 1/s）方面，Octet HTX系統(tǒng)存在一定的挑戰(zhàn)，為了克服解離階段基線偏移的問題，建議測定時使用新的探針而不要使用再生的探針。
總體而言，以Biacore為代表的SPR分子互作儀特別適合深度動力學(xué)研究（尤其適合測定KD值大于1 mM的超低親和力和解離速率特別慢的超高親和力）和小分子藥物開發(fā)；而Octet為代表的BLI分子互作儀則更適合抗體庫初篩、蛋白互作快速驗(yàn)證和工業(yè)化高通量場景。實(shí)際應(yīng)用中，許多實(shí)驗(yàn)室會互補(bǔ)使用這兩款不同類型的分子互作儀——BLI初篩后SPR深度驗(yàn)證。當(dāng)然，現(xiàn)在的BLI分子互作儀也有精度很高和重復(fù)性很好的型號（Octet R8e和Gator Plus），和Biacore分子互作儀一樣適合小分子到大分子之間mM-pM親和力的測定。
SPR和BLI無標(biāo)記檢測技術(shù)的應(yīng)用
SPR和BLI無標(biāo)記檢測技術(shù)憑借其獨(dú)特優(yōu)勢，在多個領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用[11-15]，為科研與產(chǎn)業(yè)發(fā)展帶來了巨大變革。在生命科學(xué)基礎(chǔ)研究中，它們幫助科研人員深入探索生物分子之間的奧秘，揭示生命活動的本質(zhì)；在藥物研發(fā)領(lǐng)域，顯著加速了新藥的研發(fā)進(jìn)程，提高研發(fā)效率和成功率；在疾病診斷、食品安全檢測和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域，也可以發(fā)揮一定的作用，為保障公眾健康和生態(tài)安全貢獻(xiàn)力量。
生命科學(xué)基礎(chǔ)研究：在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用研究里，能助力解析細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路中關(guān)鍵蛋白如何精準(zhǔn)互作，研究免疫細(xì)胞激活時各類信號蛋白間的關(guān)聯(lián)；DNA-蛋白質(zhì)相互作用分析方面，可幫助探究轉(zhuǎn)錄因子與特定DNA序列結(jié)合的模式，明確基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)制；抗體-抗原相互作用研究中，有助于評估抗體的特異性和親和力，為免疫機(jī)制研究提供關(guān)鍵數(shù)據(jù)。
藥物研發(fā)：在藥物靶點(diǎn)篩選環(huán)節(jié)，通過檢測候選靶點(diǎn)與藥物分子的結(jié)合情況，快速精準(zhǔn)鎖定有潛力的藥物靶點(diǎn)；先導(dǎo)化合物優(yōu)化時，能測定化合物與靶點(diǎn)結(jié)合的動力學(xué)參數(shù)，為優(yōu)化藥物分子結(jié)構(gòu)、提升藥效提供依據(jù)；在生物藥質(zhì)量控制上，可有效監(jiān)測生物藥與靶點(diǎn)的結(jié)合活性，保障藥品質(zhì)量和穩(wěn)定性。
疾病診斷：通過檢測樣本中病原體（如病毒、細(xì)菌）與特異性抗體或核酸探針的相互作用，實(shí)現(xiàn)傳染病的快速診斷。靈敏捕捉血液、體液中微量腫瘤標(biāo)志物（如癌胚抗原、前列腺特異性抗原）與對應(yīng)抗體的結(jié)合信號，實(shí)現(xiàn)腫瘤的早期篩查和病情監(jiān)測，為癌癥的早診早治提供依據(jù)。
食品安全檢測：能對食品中的農(nóng)藥殘留、獸藥殘留進(jìn)行高靈敏檢測，例如快速測定蔬菜水果中的有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量；也可用于檢測食品中的微生物污染，例如檢測奶制品中的大腸桿菌等致病菌。
環(huán)境監(jiān)測：在檢測環(huán)境污染物時，對水體中的重金屬離子、有機(jī)污染物的檢測靈敏度高，能及時發(fā)現(xiàn)水體污染情況。
結(jié)語和展望
自第一臺SPR分子互作儀上市35年以來，無標(biāo)記實(shí)時檢測技術(shù)已經(jīng)取得了長足的發(fā)展。SPR和BLI作為兩大核心的無標(biāo)記生物分子相互作用檢測技術(shù)，能夠在接近自然生理狀態(tài)的條件下，直接、靈敏且定量地揭示分子間結(jié)合的快慢、強(qiáng)弱和特異性。無論是深入探索生命活動的機(jī)制、加速新藥研發(fā)的進(jìn)程，還是確保生物制品的質(zhì)量，SPR和BLI都以其獨(dú)特的“無標(biāo)記“優(yōu)勢，成為了現(xiàn)代生命科學(xué)研究和生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)不可或缺的檢測技術(shù)。
隨著科技的不斷進(jìn)步，SPR和BLI技術(shù)也在持續(xù)創(chuàng)新與發(fā)展。展望未來，SPR和BLI技術(shù)有望在檢測靈敏度、通量、自動化程度以及與其他技術(shù)的聯(lián)用等方面取得更大突破，進(jìn)一步拓展應(yīng)用場景，在未來生命科學(xué)探索和人類健康事業(yè)中發(fā)揮更加重要的作用。
參考文獻(xiàn): 1. https://www.sprpages.nl/2. Biacore的基礎(chǔ)課程資料3. https://nicoyalife.com/products/spr-instruments/openspr/ 4. Seung-Woo Kim, Gee-Hong Kim. Thickness-profile measurement of transparent thin-film layers by whitelight scanning interferometry. Applied Optics, 1999, 38(28): 5968-5973. 5. Ana Jug, Toma? Bratkovi?, Janez Ilaš. Biolayer interferometry and its applications in drug discovery and development. TrAC Trends in Analytical Chemistry, 2024, 176: 117741. 6. Jennifer D. Stone, Adam S. Chervin, David H. Aggen, David M. Kranz. Chapter eight - T Cell Receptor Engineering. Methods in Enzymology, 2012, 503: 189-222. 7. Kimmtrack Assessment Report (EMA/206916/2022). 8. Yasmina Abdiche, Dan Malashock, Alanna Pinkerton, Jaume Pons. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Analytical Biochemistry, 2008, 377(2): 209-217. 9. Danlin Yang, Ajit Singh, Helen Wu, Rachel Kroe-Barrett. Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics. Analytical Biochemistry, 2016, 508: 78-96. 10. Vishal Kamat, Ashique Rafique. Designing binding kinetic assay on the bio-layer interferometry (BLI) biosensor to characterize antibody-antigen interactions. Analytical Biochemistry, 2017, 536: 16-31. 11. Ji?í Homola. Surface Plasmon Resonance Sensors for Detection of Chemical and Biological Species. Chemical Reviews, 2008, 108(2): 462-493. 12. Noemi Bellassai, Roberta D'Agata, Vanessa Jungbluth, Giuseppe Spoto. Surface Plasmon Resonance for Biomarker Detection: Advances in Non-invasive Cancer Diagnosis. Frontiers in Chemistry, 2019, 7: Article 570. 13. Greg Hussack, Toya Nath Baral, Jason Baardsnes, Henk van Faassen, Shalini Raphael, Kevin A. Henry, Jianbing Zhang, C. Roger MacKenzie. A Novel Affinity Tag, ABTAG, and Its Application to the Affinity Screening of Single-Domain Antibodies Selected by Phage Display. Frontiers in Immunology, 2017, 8: Article 1406. 14. Latesh Lad, Sheila Clancy, Maria Kovalenko, Chian Liu, Terence Hui, Victoria Smith, Nikos Pagratis. High-Throughput Kinetic Screening of Hybridomas to Identify High-Affinity Antibodies Using Bio-Layer Interferometry. Journal of Biomolecular Screening, 2015, 20(4): 498-507. 15. Ryo Matsunaga, Kan Ujiie, Mayuko Inagaki, Jorge Fernández Pérez, Yoshiki Yasuda, Shinya Mimasu, Shinji Soga, Kouhei Tsumoto. High-throughput analysis system of interaction kinetics for data-driven antibody design. Scientific Reports, 2023, 13: Article 19417.
